苹果（Malus domestica Borkh.）是一种在世界各地广泛种植的水果作物，但经常遭受盐和寒冷等非生物胁迫。赤霉素（Gibberellic acid，GA）在控制植物发育、环境适应性和次生代谢方面发挥着关键作用。GA2氧化酶（GA2-oxidase，GA2ox）负责生物活性GA的失活。在本研究中，在苹果基因组中鉴定了17个GA2氧化酶基因，根据系统发育关系和保守的结构域结构，这些成员可以分为四个分支。MdGA2ox7在各种组织中表现出强大的表达，对冷处理和盐处理有反应，并通过光诱导的花青素积累在苹果果皮中触发。亚细胞定位预测和实验证实MdGA2ox7位于细胞质中。MdGA2ox7在拟南芥中的过表达导致活性GA水平降低，并导致GA缺乏表型，如矮化和延迟开花。MdGA2ox7与褪黑素（melatonin，MT）协同减轻了拟南芥和苹果的冷胁迫和盐胁迫损伤。此外，MdGA2ox7增强了苹果愈伤组织中花青素的生物合成，并激活了参与花青素合成的基因。这些发现为苹果GA2ox在调节发育、抗逆性和次生代谢中的作用提供了新的见解。

图1  GA2氧化酶基因家族成员的系统发育树、基因结构和保守基序分析。（A） 基于Jones Taylor Thornton（JTT）矩阵模型和gamma（G）分布的表示系统发育关系的邻居连接树。不同的阴影表示不同的子组。进行了500次重复的Bootstrap分析，以评估系统发育拓扑的可靠性。（B） 基因结构分析。使用GSDS在线分析工具显示基因结构图。左侧面板所示的系统发育树是用JTT+G方法构建的。不同的阴影表示不同的子组。（C） 保守基序预测。保守基序在不同的GA2氧化酶基团的N-末端显示出氨基酸序列特征。星号突出了保守氨基酸的差异。

图2  MdGA2ox家族基因的时空表达特征。（A） MdGA2ox基因在不同组织中的表达谱。（B） MdGA2ox基因在开花诱导过程中的表达动态。（C） MdGA2ox基因在苹果皮中的表达模式在光照条件下经历从绿色到红色的颜色转变。对于（B）和（C），不同块的颜色和值表示表达水平。

图3  MdGA2ox7的表达模式和MT对苹果低温和盐胁迫损伤的缓解作用。（A） GUS染色显示MdGA2ox7在不同拟南芥组织中的启动子活性。（B） GUS染色和活性测定显示MdGA2ox7启动子活性对冷胁迫和盐胁迫的反应。（C） 添加MT和不添加MT的苹果幼苗在冷胁迫和盐胁迫下的表型比较。（D） –（E）不同胁迫条件下活性氧（ROS）的检测。（D） 硝基蓝四氮唑（NBT）染色显示了在不同胁迫和MT施用条件下苹果叶片中超氧阴离子自由基的积累。（E） 苹果叶片中超氧阴离子自由基的含量。

图4  MdGA2ox7的基因克隆、蛋白质结构和亚细胞定位。（A） MdGA2ox7编码序列的PCR扩增。泳道M，DNA分子量标记。红色箭头表示目标波段。（B） MdGA2ox7蛋白的三维结构预测。MdGA2ox7的晶体结构基于已报道的OsGA2ox3数据，置信度为100.0%，覆盖率为93%。α-螺旋和β-链以不同的颜色显示。（C） 来自拟南芥（AtGA2ox1）和水稻（OsGA2ox3）的MdGA2ox7和两个GA2ox的多序列比对分析。与GA4相互作用的氨基酸（Q206、Y312、Y89、Y109和R179）用星号表示。（D） MdGA2ox7的亚细胞定位。35S:：MdGA2ox7 EGFP和对照35S:：EGFP表达盒在烟叶中瞬时表达，并使用共聚焦显微镜观察。NLS mcherry表示细胞核

图5  MdGA2ox7转基因拟南芥的生长发育表型。（A） 和（C）MdGA2ox7转基因拟南芥的开花表型。（B） 抽薹时玫瑰花结叶的数量。（D） 和（E）转基因拟南芥的节间长度。

图6  GA3喷雾处理拟南芥的开花表型。（A） 短日条件下的开花表型，有或没有GA3处理。（C） 抽薹时玫瑰花结叶的数量。（B） 活性赤霉素GA4含量。

图7  MdGA2ox7转基因拟南芥在冷冻和盐胁迫下的表型。（A） 冷冻胁迫下的表型比较。（B） 冷冻胁迫下的存活率。（C） 盐胁迫下的表型比较。（D） 盐胁迫下的子叶绿化率。

图8  MdGA2ox7转基因拟南芥在冷胁迫和盐胁迫下的损伤特征，补充MT。（A）-（C）代表了光合参数的变化。（A） 显示了野生型（Col-0）和MdGA2ox7过表达（MdGA2ox7-OX）转基因系在冷胁迫和盐胁迫下，在补充或不补充MT的情况下的叶绿素荧光成像（Fv/Fm）。（B） （C）表示Fv/Fm的比例。（D） -（F）表示在补充或不补充MT的情况下，在冷胁迫和盐胁迫下ROS的积累。（D） NBT组织化学染色显示叶片中O2的积累。（E） 和（F）拟南芥叶片中活性氧（Reactive oxygen species，ROS）浓度的定量测量。

图9 在冷胁迫和盐胁迫下，补充MT的MdGA2ox7转基因苹果愈伤组织中损伤的表征。（B） 和（C）分别表示在添加或不添加MT的冷处理和盐处理后转基因苹果愈伤组织的鲜重。

图10 MdGA2ox7在花青素生物合成中的功能分析。（A） 在23°C的恒定光照下培育20天大的转基因苹果愈伤组织。（B） 花青素含量的量化。（C） 花青素合成基因的表达水平。将EV愈伤组织中花青素含量和基因表达水平设定为1。