背景：扁豆（Lens culinaris Medik.）是一种全球重要的农业作物，用于养活数百万人口。扁豆在澳大利亚维多利亚州和南澳大利亚州已种植数十年，但现在正努力将其种植扩展到西澳大利亚州和新南威尔士州。植物结构在适应性方面发挥着关键作用，尤其是在新扩展地区，能提高和稳定产量。基于图像的高通量表型技术为深入了解植物发育、结构和性状遗传学提供了机会。本文描述了一种新方法，用于在玻璃温室中生长的未成熟扁豆植物上映射和量化个体分枝结构。我们使用 LemnaTec Scanalyser 3D 高通量表型平台，该平台在实验期间以受控的摄影条件下定期采集侧视 RGB 图像。开发了一种基于队列和距离的算法，该算法分析了由扁豆植物图像生成的形态学骨架，使用 Python 编写。该代码被集成到图像分析流程中，利用开源软件（PlantCV）测量扁豆植物上个体分枝的数量、角度和长度。

结果：在未成熟的植物上，可以准确识别和量化分枝结构，这足以计算早期生长性状，但随着植物的成熟，准确性下降。22 天后播种（DAS）植物的分枝计数绝对准确率为 77.9%，29 DAS 为 57.9%，36 DAS 为 51.9%。允许误差为±1根分枝时，相应的准确率为 97.6%、90.8% 和 79.2%。成熟植物中的遮挡使得分枝的映射准确性降低，但收集的信息仍然对性状估计有用。对于分枝长度计算，线性混合效应模型解释的方差量为82%（地理长度）和87%（欧几里得分枝长度）。在这些模型中，分枝的平均地理和欧几里得距离测量显著受基因型、DAS 及其相互作用的影响。从分枝角度的计算中得出了两个信息丰富的指标；‘扩张度’是衡量分枝角度偏离完全竖直的程度，而‘角度差’是每株植物上记录的最小和最大分枝角度之间的差异。线性混合效应模型解释的方差量为38%（扩张度）和50%（角度差）。这些较低的R²值可能由于测量这些参数的固有困难，但仍然发现扩张度和角度差显著受品种、DAS及其相互作用的影响。当在玻璃温室实验中种植了276种不同的扁豆基因型，其中部分样本接受了盐处理时，分枝算法能够根据分枝计数的差异区分盐处理和未处理的扁豆品系。同样，分枝的平均地理和欧几里得距离测量都显著受到品种、DAS 和盐处理的影响。线性混合效应模型解释的方差量为 57.8%（地理分枝长度）和 46.5%（欧几里得分枝长度）。

结论：该方法能够准确量化玻璃温室中生长的扁豆植物的分枝数量、角度和长度。这种方法可以应用于其他双子叶植物。

图1 扁豆生长情况：A. 扁豆幼苗生长在直径为200毫米的白色盆中，周围有蓝色支撑笼，位于LemnaTec Scanalyser 3D表型平台上。B. 通过LemnaTec Scanalyser 3D表型平台摄像头捕捉的扁豆植株典型RGB图像。C. 扁豆植株通过传送带从温室运送到成像柜。D. 实验1结束时，在LemnaTec Scanalyser 3D表型平台上的成熟扁豆植株。

图2 扁豆分枝图像分析流程的阶段表示：A. 原始RGB图像的裁剪部分；B. 通过CMYK转换得到的‘Y’通道，生成灰度图像以帮助分离植物与背景；C. 根据Y通道生成的二值化图像，灰度级阈值为63；D. 对二值化图像施加的9x9像素膨胀，以连接部分对象；E. 通过CMYK转换得到的‘M’通道，生成灰度图像用于分离支撑笼；F. 根据M通道生成的二值化图像，灰度级阈值为55；G. 对植物和支撑笼的阈值化图像应用像素级逻辑与运算，以识别重叠的像素，恢复被笼子遮挡的植物部分；H. 不包含支撑笼的植物二值化图像；J. 通过CMYK转换得到的‘K’通道，生成灰度图像，用于分离可见的培养土。这被阈值化以创建一个二值化图像；K. 通过将反转的培养土掩模和植物掩模进行像素级逻辑与操作，从植物掩模中减去培养土；L. 对二值化掩模施加的13x13像素膨胀；M. 从L中二值形状衍生的骨架。注意到两个不连通的部分；N. 显示每个像素距离盆顶的距离的热图，其中较大的距离值映射为较浅的像素值；P. 在所有环路被移除、侧向分支被裁剪并恢复小独立分枝时，从骨架导出的独特分枝线叠加在原始RGB图像上。

图3 简化的二进制骨架示意图，用于识别到达基部（通常是培养土水平）的独特分枝的处理过程：A. 骨架由23个像素组成，包括一个主分枝及其左右各一个侧分枝。请注意，骨架的基部用测地距离值为1的方式突出显示。端点像素显示为橙色，平板像素显示为粉红/红色，交叉点像素显示为蓝色。每个像素都有从基点测量的测地距离值（显示为像素内部的数字）。基于队列的算法按顺序处理每个分枝，从最长分枝的端点开始（用黄色箭头突出显示）。跟踪过程中，当前位置由具有蓝色边框的像素表示，将每个访问的像素设置为0，并使用8连接的邻域（虚线框）沿分枝向下移动，以识别具有最小距离值的相邻像素，然后移动到该位置。B. 主分枝的所有像素都被设置为零。请注意，跟踪过程在具有测地距离值为1的像素处终止；因此，这是一个独特的分枝。突出显示了左侧分枝的起始条件。C. 左侧分枝的所有像素都已设置为零，并且跟踪过程在具有距离值为7的像素处终止，这比1大。请注意，突出显示了右侧分枝的起始条件。D. 右侧分枝的所有像素都已设置为零。请注意，右侧分枝在具有距离值为4的像素处终止，这比1大。

图4 像素p周围的像素邻域表示：在欧几里德几何中，4连接像素的距离值为1（浅绿色），而8连接像素的距离值为√2（深绿色）。这种表示用于描述像素p周围的连接情况，4连接意味着像素p与其上、下、左、右四个相邻像素相连接；而8连接则还包括对角线上的相邻像素。

图5 盒形图显示在实验1中，扁豆分枝算法对每个扁豆品种在0°、20°、40°、60°和80°成像角度下计数的平均分枝数分布，这些数据已经合并。平均值用橙色十字标出。实验中发现，拍摄图像的成像角度对分枝计数没有显著影响（p = 0.5751）。

图6 在实验1中，通过分枝算法计算的扁豆植株随时间观察到的平均分枝数，根据先前报道的分枝表型分类分组，如图例所示。请注意，从第23天到第32天（阴影部分），报告的分类与算法收集的测量结果一致。这些表型数据是由维多利亚农业部门在几年的田间试验中收集的。

图7 盒形图显示在实验1中，扁豆分枝算法计算的每个扁豆品种分枝的测地长度分布。平均值用橙色十字标出。请注意，所有品种的分枝测地距离随时间增加，并且在不同品种之间存在差异。数据在第19天和第20天中断是由于机械故障导致这两天无法采集图像。

图8 盒形图显示在实验1中，扁豆分枝算法计算的每个扁豆品种分枝展开度的分布。平均值用橙色十字标出。此图展示了不同扁豆品种之间分枝结构表型的变异性。

图9 盒形图显示在实验1中，扁豆分枝算法计算的每个扁豆品种角度差异的分布。平均值用橙色十字标出。

图10 实验2中使用扁豆分枝算法计算的每个处理组在第14、18、25、28和35天的分枝计数分布柱状图。误差条显示95%的置信区间。

图11 在实验2中，根据扁豆分枝算法计算的平均欧几里得分枝长度（A）、平均测地分枝长度（B）、平均分枝数量（C）和平均展开度（D），将植物分组为根据其报告的耐盐性分为“高度耐受”、“耐受”、“中度不耐受”、“不耐受”或“高度不耐受”，在第14、18、25、28和35天展示的柱状图。误差条显示标准误差到95%置信区间。