图1  猴面花物种之间的色素模式变化（A）四种猴面花物种之间的系统发育关系，估计有分化时间。每种物种都显示了花朵的前视图（左）和解剖图（右）。为了制作解剖图，沿着两个背花瓣之间的交界处切开花冠，然后压平并用扫描仪扫描。背面（D）、侧面（L）和腹侧（V）花瓣标记在M.lewisii花图像上，黄色花蜜引导（NG）区域和花冠管（CT）分别由虚线框和括号表示。（B和D）共聚焦荧光图像显示了M.lewisii（B）和M.cardinalis（D）在早期花冠发育阶段（≤6 mm）的RTO启动子活性。（C和E）M.lewisii（C）和M.cardinalis（E）晚花冠阶段（≥6mm）的扫描图像。花青素图案的相应示意图也显示在（C）和（E）中的扫描图像上。

 图2  NEGAN表达的制备模式（A）将M.lewisii NEGAN等位基因（NEGANL）引入M.cardinalis，即使在杂合状态下，也会导致模式从纵向条纹变为无序斑点。（B至G）在早期花冠发育阶段（长度为0.5、1.0和2.0mm），M.lewisii NEGAN启动子的报告系（proNEGANL）与M.cardinalis NEGAN发起子（proNEGANC）显示出不同的荧光模式。前者（B、D和F）显示脊相关YFP信号，而后者（C、E和G）显示静脉相关模式。（H和I）将2.0mm花冠阶段的共聚焦荧光图像与亮场图像合并。静脉-12至12由白色箭头表示。（J和K）YFP强度图，位于（D）和（E）中的方框区域内。静脉-7至7的相对位置在x轴上表示。

图3  RTO启动子活性在模式变异中的作用（A和B）野生型M.parishii（A）和RTOC/C NIL（B）的正面和解剖图。（C） 对M.parishii和M.cardinalis之间的F1杂交的等位基因特异性表达分析表明，与M.cardinals（Mcar）等位基因相比，F1 RNA-seq数据中更多的读数被特异性地定位到M.parishi（Mpar）RTO等位基因。误差条为三次生物复制的1 SD。（D） 烟草叶片中的双荧光素酶检测表明，NEGAN可以比M.cardinalis版本更强烈地激活M.parishii RTO启动子。误差条为五个生物重复的1 SD。右侧显示了在黑暗中拍摄的LUC的代表性实时图像。（E） M.parishii中的RTO RNAi和CRISPR（rtoCR1）突变系显示了一系列花青素色素模式。

 图4  BH2预模式在纵向条纹形成中的作用（A）扫描图像显示了不同基因型中的花青素色素模式。（B） RTOC/CBH3C/C双NIL背景中的BH2 RNAi谱线。（C） RTOC/C和RTOC/CBH2C/C NILs在早期发育阶段的花青素模式。在RTOC/C NIL的2.5mm阶段很容易看到斑点，但直到RTOC/CBH2C/C双NIL的3.5mm阶段才可见斑点。（D和E）与M.cardinalis等位基因（E）相比，M.parishii等位基因的BH2启动子报告系（D）显示出更宽的荧光模式。

图5  BH3启动子活性的表征（A）RTOC/CBH2C/C双NIL背景下proBH3C:BH3P的转基因表型。（B和C）M.parishii（B）和M.cardinalis等位基因（C）的BH3启动子报告子显示出与花青素色素斑点一致的相似荧光模式，后者显示出更强的信号。（D） F1杂种中的等位基因特异性表达分析。（E） 烟草叶中的双荧光素酶测定表明，NEGAN 激活的 M. cardinalis BH3 启动子比 M. parishii 版本更强。右侧显示了在黑暗中捕获的 LUC 的代表性实时图像。误差线为五个生物学重复的 1 SD。

图6  基于三物质RD模型的各种色素沉着模式的计算机模拟（a）模型中实现的偏微分方程。a, ℎ, s, c: 活化剂（NEGAN）、抑制剂（RTO）、辅活化剂（bHLH）和NEGAN-bHLH活化复合物的浓度；p: 活化常数；o: NEGAN或RTO与bHLH之间的结合亲和力；y: 预模式的强度；a: 基线生产率；u: 降解速率；D : 扩散速率；p, v : 分别是NEGAN和bHLH的预模式。用于模拟野生型（WT）M.parishii图案的预图案和参数值的图示显示在方程的右侧。（B至O）野生型M.parishii（B）、各种转基因系（C-H）和NIL（I-O）的色素模式的模拟。所有模拟都使用了相同的NEGAN预模式。使用M.parishii BH2P和M.cardinalis BH2C预模式作为共激活剂预模式来模拟基因组。