叶片叶绿素含量在反映植物胁迫和营养状况方面起着重要作用。本研究分别利用RGB、高光谱和荧光成像技术对温室环境下15个基因型的高粱植株的图像进行了采集，开展叶绿素含量检测研究，进行了如下研究：(1)开发和验证一种基于多角度采集图像并进行处理分析的方法，用于无损测量单个植株的叶绿素含量;(2)研究如何通过包括DAS(播种后天数)和SLW(比叶重)等其他辅助变量来提高叶绿素估测精度;(3)评估高通量表型图像作为快速估算植物叶绿素含量空间分布工具的潜力;(4)探索不同空间和光谱分辨率的多传感器进行数据融合来有效预测植物叶绿素含量。

　　研究使用了15种不同的高粱基因型，开展了水分条件和养分条件的多因素多水平试验。由种植后定期采集的图像可见，DAS之间的植物生长情况视觉差异明显(图7)。

　　Figure. 8 The sequential steps in segmentation of plant pixels from the background

　　从可见光图像提取植物像素的处理过程

　　基于MATLAB从BIL(Band Interleaved by Line)文件中提取高光谱成像中各个光谱波段，构建243幅高光谱图像。对植物图像进行单独处理，提取像元光谱强度，利用植被反射率的快速增加来实现高光谱图像中植物像元的分割。图10位对高光谱图像进行处理的步骤。利用比值植被指数(RVI)、归一化植被指数(NDVI)、改良叶绿素吸收比指数(MCARI)等算法测量植物冠层覆盖度和叶绿素含量。这些比值和算法分别代表归一化光谱指数、比值光谱指数和多波段组合光谱指数。

　　Figure. 7 Photos of the planted sorghum with different DAS (days after sowing).

　　在不同DAS(播种后天数)的高粱生长情况图

　　利用高通量植物表型系统(Scanalyzer3D, LemnaTec GmbH, Aachen, Germany) 进行高通量图像采集，三个成像室分别配备了可见光(RGB)、高光谱和荧光成像设备。使用Matlab对RGB、高光谱和荧光图像进行图像处理。图像处理的主要任务是从RGB、高光谱和荧光图像中提取植物像元，从中提取基于图像的植物表型信息。

　　可见光相机采集过程中，每棵植物拍摄10张2454*2056的RGB图像:(植物在托盘上水平旋转，每36度拍摄1张，共采集10张侧视图图像)。为了比较叶绿素含量与颜色特征的估计，基于图像处理技术，确定RGB空间的红色(R)、绿色(G)和蓝色(B)的颜色分量，利用色彩空间转换技术，增加植物区域与背景区域的对比度，提取植物在HSI空间的色相(H)、饱和度(S)和强度(I)信息。

　　Figure. 10 Flowchart showing the steps in hyperspectral image analysis to obtain apparent reflectance spectra

　　获得叶绿素荧光图像后，分析整株植株的叶绿素含量。利用感兴趣区域像素数估计整个植株的面积，并用于监测植株生长。确定有效阈值，将植物像元从背景中分割出来。然后将植物不同程度侧视图的荧光图像平均为植物投影面积。荧光图像处理过程示意图如图11所示。

　　Figure. 11 Process flow of image processing steps used in the extraction of plant’s projected chlorophyll content from the fluorescence images.

　　从荧光图像中提取植物的叶绿素含量的图像处理步骤

　　80%的数据用于模型校准，20%的数据用于模型验证。利用R软件计算模型评价的统计量，赤池信息准则(AIC)用于衡量统计模型的拟合性能。

　　表2 不同成像传感器提取的参数与叶绿素含量的估测模型

　　Table.2 Estimation error for different multiple linear models used to estimate chlorophyll content for various imaging technology

　　综合从可见光、高光谱和荧光图像中获取的所有变量进行数据融合，利用偏最小二乘回归(PLSR)对高粱植株叶绿素含量进行建模。

　　表3利用不同成像数据融合的植株叶绿素含量的估测结果

　　Table.3 Test results of using the selected vegetation indices computed from different imaging data and SLW to predict chlorophyll content for sorghum plants

     作者介绍：南京林业大学的张慧春教授团队长期从事植物表型平台和技术研究，与美国内布拉斯加大学林肯分校的Ge Yufeng教授团队密切合作，开展了植物在生物胁迫与非生物胁迫下形态结构、生理生化特性的高通量表型研究，致力于将工程技术引入表型分析，从而推动智能育种和精确管理的发展。

     来源：Zhang, H., Ge, Y., Xie, X. et al. High throughput analysis of leaf chlorophyll content in sorghum using RGB, hyperspectral, and fluorescence imaging and sensor fusion. Plant Methods. 2022，18：60