高温严重威胁作物生产，当环境温度升高10-15°C时被认为是热休克或热应激。暴露在高温下限制了植物的生长和发育，并降低了许多蔬菜作物的产量和质量，如生姜、辣椒、番茄和黄瓜。黄瓜是一种嗜热作物，当环境温度高于最佳温度(25-30°C)时，热胁迫诱发黄瓜叶片和茎干枯萎，影响黄瓜的正常生长、光合作用和果实结果，因此，热胁迫下的黄瓜表现出过早老化，产量减少和水果适销性降低。

光合作用是植物受高温影响的敏感生理过程，大量研究表明光系统II (PS II)的热敏性主要源于叶绿体类囊体膜流动性的增加以及PS II完整性对电子动力学的依赖。因此，植物有各种各样的反应机制来减轻高温胁迫的负面影响。例如，在高温条件下，叶片定向调节和叶片卷动等避免机制有利于植物的净光合作用。此外，抗热胁迫的生物化学和分子机制促进了作物的生长和经济产量。例如，离子运输、抗氧化防御诱导、PS I周围循环电子流增强、次生代谢产物的产生、信号级联和转录调控因子的激活等抑制了高温对光合作用的影响。

碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族是植物中最大的转录因子基因家族之一，在各种植物的生长和胁迫响应中起着至关重要的作用。SPATULA (SPT)是一种可调节多种植物果实发育的bHLH转录因子，包括拟南芥、草莓、桃子和茄科物种。SPT在拟南芥中通过调节根的生长和种子从休眠到萌发的转变，以响应寒冷和光照，此外，SPT以PHYB依赖的方式控制拟南芥的光形态发生发育。最近，CsSPT已被证明通过与另一种bHLH转录因子ALCATRAZ相互作用而导致黄瓜果腔和雌性不育。然而，SPT对高温的响应性尚未被研究。

为研究SPT对高温的响应性，我们在高温胁迫下的耐热(Thermotolerant，TT)和热敏(Thermosensitive，TS)黄瓜品系中鉴定了75个bHLH基因的4个表达簇，结果显示，高温条件下TT黄瓜CsSPT表达增加。然而，通过CRISPR-Cas9系统获得的CsSPT突变体植株在使用光合表型成像系统PlantExplorer测量后，成像图片中明显看出植株表现出严重的热敏症状，包括叶片枯萎，边缘棕色，根系密度和细胞活性降低。此外，转录组分析表明，由于高温胁迫，CsSPT突变体植株的相对电解质渗漏(REC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和超氧自由基(O2.-)水平较高，脯氨酸含量降低，与野生型（Wild type，WT）植物相比，CsSPT突变体的光系统和叶绿体活性受到高温胁迫的严重破坏，且在高温胁迫下，突变体CsSPT的激素信号转导、MAPK和钙信号通路均被激活，植株中bHLH、 NAC和bZIP家族转录因子的表达受到抑制。

这些研究结果表明，CsSPT可通过光合作用、信号通路分子和转录因子来调控高温响应。功能性CsSPT敲除为育种耐热作物品种提供了一个潜在的有价值的靶点。筛选具有最佳雌性不育性和耐高温性的CsSPT转基因对黄瓜育种带来巨大的经济效益。

图1 TT和TS不同高温暴露时间下黄瓜CsbHLHs的表达谱

A-B: CsbHLHs在TT (A)和TS (B)黄瓜高温处理0 h (CK)、0.5 h (H0.5)、3 h (H3)、6 h (H6)和12 h (H12)的差异表达。TT表示耐热，TS表示热敏。C-J: TT (C-F)和TS (G-J)黄瓜高温处理后bHLHs的表达谱。直径图表示不同基因谱的表达趋势，左上数字表示基因谱，左下数字表示基因量。

图2 黄瓜CsSPT突变耐高温分析

A：CRISPR-Cas9系统形成的CsSPT移码突变，蓝色矩形表示外显子，黑线表示内含子，第一个外显子中的红框表示CRISPR系统的目标区域。B-R：野生型和CsSPT突变体在常温和3d高温胁迫下的表型特征(B-E)、根(F-I)、根细胞活力(J-M)、茎(N-Q)、茎交叉面积(R)。S：WT和CsSPT突变体暴露于高温胁迫3天后的热损伤水平。比例尺为2cm (B-I)， 200 μm (J-M)， 1cm (N-Q)。(R)中的误差柱表示9个生物重复的标准差。

双星号(**)表示在P< 0.01的显著性水平上差异显著(Student’s t-test)。

图3 高温处理后叶绿素荧光与生理因素分析

A-F：WT和CsSPT高温胁迫3d后的Fv/Fm (A-B)、Fq ' /Fm ' (C-D)和ETR (E-F)值。Fv/Fm表示PSII光化学最大量子产量，Fq ' /Fm '表示光合作用效率，ETR表示相对电子转移速率。NT表示常温，HT表示高温。G–L：EC (G) , MDA (H), GSH (I), O2.- (J), Pro (K), H2O2 (L) 含量分别为WT和CsSPT突变体在常温和高温胁迫3 d后的含量。(G-L)中的误差柱表示9个生物重复的标准差。利用光合表型成像系统PlantExplorer测量。

双星号(**)和星号(*)分别表示在P < 0.01和P < 0.05显著性水平上差异显著(Student’s t-test)。

图4 WT和CsSPT突变体在正常和高温条件下的转录分析

A：不同比较下的DEG数量，蓝色代表上调基因，红色代表下调基因，x轴表示基因数量，y轴表示不同的比较，CsSPT-HT vs WT-HT表示高温条件下CsSPT与WT的比较。B：WT和CsSPT突变植株在正常和高温下基因表达模式的热图，右边的彩色条表Z-score标准化FPKM值，绿色、橙色、蓝色和红色部分代表WT-CK、WT-HT、CsSPT-CK和CsSPT -HT的三种生物学重复。C：推测与热应激反应相关的光系统和叶绿体相关基因。D：CsSPT -CK与WT-CK的GO分析，从内到外，第一个环代表GO富集分析，其黄色、蓝色和绿色部分分别代表生物过程、分子功能和细胞成分；第二个环表示每个GO项中的基因数量，其深紫色浅紫色条分别表示上调和下调的基因；第三个环表示p值，浅红色条表示基因数量，深红色条表示较小的p值；第四个环表示GO术语，而右边的表包含GO标识(ID)及其描述。

图5 高温处理后Csspt和WT植物GO富集差异

A-B：CsSPT -HT vs CsSPT -CK (A)和WT-HT vs WT-CK (B)前15个GO富集项。C：高温处理后CsSPT突变体和WT植物基因表达的热图。D：高温处理后CsSPT突变体与WT植株KEGG富集项前15名。CK和HT分别代表常温和高温。

图6 高温对转录因子家族基因表达的影响

A：WT和CsSPT突变株高温处理后转录因子基因数量。WT HT/CK和CsSPT HT/CK分别代表WT-HT vs WT-CK和CsSPT-HT vs CsSPT-CK。B：高温处理后WT和Csspt突变植株转录因子基因的维恩图。C: WT和CsSPT突变体植物高温处理后b-ZIP、NAC、HSF/HSP和bHLH转录因子基因的表达谱；深蓝色和红色的方阵表示log2值，而黄色和浅蓝色的正交表示折叠变化。