世界人口正以前所未有的速度增长。农业为不断增长的人口提供食物，也正达到其空间和自然资源的极限。此外，不断变化的立法和不断提高的生态意识迫使农业减少对环境的影响，用基于自然的解决方案取代农用化学品成为必要。在这方面寻找有效的生物防治剂以保护作物免受病原体的侵害成为人们关注的焦点。本研究中，我们探究了药用植物散沫草（Alkanna tinctoria Tausch）内生细菌的生物防治活性。为此，首先对大量的菌株进行基因组测序，并通过生物信息筛选与植物刺激和生物防治相关的特征。基于这一信息，在平板试验和植物离体叶片测定中使用直接拮抗作用在体外测试所选细菌抗真菌活性。对菌株进行了单独和组合测试，以评估表现最佳的处理方法。结果表明，许多细菌都能产生有效抑制多种真菌增殖的代谢产物，尤其是禾谷镰孢菌。其中，假单细胞菌菌株R-71838在双培养和植物试验中均表现出较强的抗真菌作用，是生物防治应用最有希望的候选菌株。通过利用药用植物中的微生物，这项研究强调了利用基因组信息来加速筛选具有生物防治特性的一组分类学上多样化的细菌的机会。

植物病原真菌是全球粮食生产的主要威胁。预防植物感染最常见的管理做法是大量使用杀菌剂。然而随着人们日益认识到化学品对生态和人类的影响需要采取替代策略，例如使用细菌生物防治剂。细菌生物防治设计的局限性包括需要进行耗时耗力实验来测试种类繁多的菌株，并且它们对病原体的活性缺乏可重复性。本研究中，我们发现基因组信息是一个可以快速选择感兴趣的细菌有效的工具。此外，我们还发现假单胞菌属菌株R-71838在体外和植物中都具有可重复的抗真菌作用。这些发现为设计基于假单胞菌属菌株R- 71838的生物防治策略奠定了基础。

本实验中评估离体叶片测定利用光合表型成像平台(CropReporter; Phenovation, Wageningen, The Netherlands)，平台基于特定的吸收、发射和反射模式实时监测几个生理特征。采用电荷耦合器件(CCD) 6 Mp-16位摄像系统，可在高时空分辨率下监测红绿蓝(RGB)值、叶绿素荧光(Fv/Fm)、叶绿素指数(ChlIdx)、GFP荧光等光谱参数。叶绿素荧光(Fv/Fm)表示光系统II在暗适应状态下的效率，它代表叶片健康和伴随胁迫水平。叶绿素指数(ChlIdx)代表叶片叶绿素含量，用来测量叶片绿度。将改良的花青素反射率指数(mARI)作为花青素积累的指标，这可能与活性氧迸发和植物防御系统有关。

图1 用于全基因组测序的细菌菌株的系统发育树。分支顶端包含的菌株编码为黑色(用于体外抗真菌筛选的细菌)，未选中的菌株为灰色，背景颜色表示它们所属的不同分类群(细菌纲)。与植物-微生物相互作用相关的性状显示在第1-5层。第1层和第2层分别表示1-氨基环丙基-1-羧酸(ACC)脱氨酶和吲哚-3-乙酸(IAA)注释酶/通路的存在(圆形或方形，纯色)或缺失(圆形或方形，无色)。第3层和第4层为纤维素和果胶降解酶的基因丰度;圆圈大小反映了基因的数量。最后第5层为根据不同颜色按类型分布的生物合成基因簇(BGCs)数量

表1 63株菌株尖孢镰孢菌MUCL 781、立枯丝核菌MUCL 9418、终极腐霉菌MUCL 53834在25 ℃培养144 h以及禾谷镰孢菌PH-1培养96 h后真菌生长的影响(双培养试验)a

 注：a使用以下类别记录效果(示例如图2所示)：A类，细菌在各个方向抑制真菌生长；B类，细菌抑制菌落附近的真菌生长；C类，细菌在平板上扩散并在接触后抑制真菌生长；D类，细菌在接触后抑制真菌生长但不扩散；E类，细菌对真菌生长无影响。用antiSMASH计算BGCs。NT，未测试

图2 抑制类别在双培养试验中定义。针对下列植物病原真菌，列出了每种类型的代表性细菌处理方法：尖孢镰孢菌MUCL 781，立枯丝核菌MUCL 9418，终极腐酶MUCL 53834和禾谷镰孢菌PH-1。最上面一行显示没有细菌的对照。A类，细菌在各个方向抑制真菌生长；B类，细菌抑制细菌菌落附近的真菌生长；C类，细菌在平板上扩散并在接触后抑制真菌生长；D类，细菌在接触后抑制真菌生长但不扩散；E类，细菌对真菌生长无影响

图3 箱线图表示对选定的细菌处理和组合（SynCom实验）在小麦离体叶片上接种的真菌生物量积累（自发荧光校正的GFP荧光[cGFP])、叶绿素荧光(Fv/Fm)、花青素含量(mARI)的效果，用禾谷镰孢菌PH-1培养72 h (n=4 生物学重复)。未感染的阴性对照接种10 μL PBS。与感染对照组相比，差异有统计学意义(***，P<0.001；**，p<0.05；*，p<0.01)；根据Dunnett检验计算统计差异。重新检测的细菌和组合用不同颜色的方框表示：假单胞菌菌株为黄色，土地杆菌菌株为绿色，短芽胞杆菌菌株为蓝色，组合为灰色

图4 相似网络，利用BiG-SCAPE对cblaster和ClusterBlast (antiSMASH)预测的BGCs进行计算，以匹配假单胞菌属R-71838中独特的BGCs(BGC区6、7、8、9、10、11、14和16)。每个集群表示为一个包含一个或多个BGC族的族，不同颜色的节点表示不同的BGC家族，粗体圆圈代表假单胞菌属R-71838的BGCs。MIBIGs 3.0数据库中包含的已知和描述的匹配BGCs也被表示出来。

图5 假单胞菌属R-71838（BGC区11，经antiSMASH鉴定）与其他具有高度相似BGCs的菌株编码环脂肽(CLPs)的BGCs基因序列比较。用clinker v0.0.25软件进行对比计算。基因1 a和2 a可能与霉素家族的CLP的生物合成有关，而基因1 b、2 b和3 b则与肽蛋白家族有关。相似性是根据氨基酸组成计算的，表示相似性在50%以上的蛋白质之间(标度0~1.0)。