RNA中的N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物中一个非常重要的转录后修饰机制。据报道，它在模式植物的一些胁迫反应中具有重要的调节作用，但在西瓜中还没有关于m6A修饰的研究。

　　在本研究中，通过生物信息学方法鉴定了三个西瓜MT-A70基因(ClMTA-ClMTC)。首先在西瓜和其他物种中鉴定了m6A甲基转移酶(MT-A70类似蛋白)，并利用这些蛋白构建了系统发育树，如图1。然后对MT-A70基因的基本信息包括序列特征、染色体位置和系统发育关系进行了研究。西瓜ClMTA-ClMTC启动子序列从葫芦基因组学数据库中下载，然后通过PlantCARE来预测顺式元素。(PlantCARE网址：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)

　　图1 西瓜中ClMTB蛋白的鉴定和亚细胞定位。(A) 对来自拟南芥、油菜、玉米、十字花科植物、茄子、高粱、葡萄、Physcomitrella patens和Citrullus lanatus的MT-70同源蛋白的系统发育分析。(B) 西瓜中ClMTB蛋白的结构。(C) MTB蛋白直系亲属中MT-70结构域的氨基酸序列排列。(D) 西瓜ClMTB蛋白的亚细胞定位。核标记(红色荧光)，明视野，ClMTB-eGFP(绿色荧光)，以及烟草叶表皮细胞中Pro35S::ClMTB-eGFP的合并图像。条形代表20微米。

　　此外，基于实时定量PCR(qRT-PCR)方法，对西瓜MT-A70s在不同组织中的表达以及对干旱胁迫的反应进行了研究，如图2，确定干旱胁迫地ClMTB的表达诱导作用较弱。

　　图2 西瓜中MT-A70s的表达模式。(A) 西瓜MT-A70基因在西瓜六个不同组织中的表达模式。根(R)，茎(S)，叶(L)，雄花(Mf)，雌花(Ff)，和果实(Fr)。(B)MT-A70s在1、4、12和24小时后对干旱胁迫(DS)和模拟(CK)的表达情况。*P < 0.05; **P < 0.01. (C)7天大的拟南芥转基因ProClMTB::GUS幼苗暴露在20% w/v PEG8000中24和48小时的组织化学GUS检测。

　　西瓜ClMTB基因被克隆，并成功构建了ClMTB过表达的烟草植物。OEMTB-3、-7和-15过表达的品系被用来进行分析，如图3。通过RT-PCR证实ClMTB在同源T3系中的异源表达。结果发现，在OEMTB-3、OEMTB-7和OEMTB-15中检测到ClMTB基因，而在野生型(WT)中没有检测到。在OEMTB-7和-15中全局m6A水平高于WT，这表明ClMTB可能是影响西瓜m6A水平的m6A甲基转移酶的一个组成部分。

　　图3 ClMTB的过量表达增加了烟草中的全球m6A甲基化水平。(A)利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，ClMTB在三个过表达的转基因系(OEMTB-3、OEMTB-7和OEMTB-15)和野生型(WT)中的表达。WT烟草被用来作为内部对照。(B) OEMTB转基因植物(-3、-7和-15)的全球m6A甲基化水平。红色星号表示与WT值的显著差异。*p < 0.05; **p < 0.01。(关于本图例中对颜色的引用的解释，请读者参考本文的网络版)。

　　研究了干旱胁迫对这些转基因品系的影响，涉及光合作用、H2O2和O2-积累、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性，以评估其对干旱胁迫的敏感性，如图4、图5。ClMTB在烟草植物中的过度表达通过增强活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除系统和减轻干旱下的光合作用抑制来提高抗旱能力.

　　图4 西瓜ClMTB的过量表达增加了烟草的抗旱性。(A-D) WT(A)和ClMTB过表达的转基因烟草株系OEMTB-3(B)、OEMTB-7(C)和OEMTB-15(D)在充足水分条件下的表型。(E-H)WT(E)和OEMTB转基因植物(-3、-7和-15)在干旱压力下的表型。(I)OEMTB和WT烟草植物的存活率。干旱处理15天后，重新浇水5天，并计算OEMTB和WT烟草植株的最终存活率。在10天时，利用PlantExplorer光合表型成像系统测量经和未经干旱处理的WT和OEMTB烟草植株的叶绿素荧光(J)和Fv/Fm(K)，红色星号表示与WT值的显著差异。*p < 0.05; **p < 0.01。

　　图5 WT和OEMTB烟草植物在干旱胁迫下的生理表型。在正常条件下(上图，CK)和启动干旱处理后10天(下图，DS)，WT和OEMTB转基因幼苗的H2O2(A)和O2-(B)检测。在正常条件下和开始干旱处理后10天，WT和OEMTB过表达植物的超氧化物歧化酶(SOD)(C)和过氧化物酶(POD)(D)活性。在正常条件下和开始干旱处理后10天，WT和OEMTB过表达植物的脯氨酸(E)和丙二醛(MDA)含量(F)，以及相对含水量(RWC)(G)。在四叶或五叶阶段，WT和OEMTB烟草植物的幼苗被暴露在干旱压力下10天，浇水充足的幼苗作为对照。显示的数据是三个重复的平均值(±SD)。用同一字母表示的平均值在P < 0.05时没有显著差异。DS: 干旱胁迫; CK: 控制，浇水良好的幼苗。

　　此外，我们分析了转录组图谱，以确定过度表达的ClMTB烟草对干旱胁迫的反应基因。这项研究为探索ClMTB调控的m6A修饰在西瓜适应干旱胁迫中的作用提供了重要证据。转录组分析表明，在干旱条件下，过表达的ClMTB植物中多种激素和胁迫反应基因被特异性诱导，如图6。这些结果表明，ClMTB介导的m6A修饰是耐旱性的一个积极调节因素。

　　图6 干旱胁迫下WT和OEMTB-15的DEGs的维恩图(Venn diagram)分析。(A) 维恩图显示干旱胁迫下WT和OEMTB-15的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。(B) 在干旱胁迫条件下，OEMTB-15中特别确定的DEGs的京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。

　　总之，ClMTB介导的m6A修饰是ROS清除、光系统成分、植物激素和多种应激反应TFs的主调控器，从而提高了烟草的抗旱能力，如图7。 本研究首次对ClMTB在西瓜适应干旱胁迫中的具体作用进行了了解，也对m6A修饰介导的响应胁迫条件的信号通路提供了重要启示。

　　图7 所提出的CIMTB介导的耐旱性模型

　　来源:Y. He, Y. Li, Y. Yao, H. Zhang, Y. Wang, J. Gao, M. Fan, Overexpression of ClMTB enhances drought tolerance in tobacco by mitigating oxidative stress and photosynthesis inhibition and modulating stress-responsive gene expression, Plant Physiology et Biochemistry (2021), doi: https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2021.10.007.

　　编辑:王春颖