CsIVP调控黄瓜低氮耐高温


发布时间:

2022-02-22

来源:

本站

作者:

PhenoTrait

  作物经历各种非生物胁迫,降低产量和质量。虽然已经确定了几种植物对单一胁迫的适应性生理和防御反应,但植物对多重胁迫的反应行为和机制仍有待研究。

 

  蛋白比对显示,CsIVP与被子植物包括Fabaceae、Rosaceae、Cucurbitaceae、Salicaceae、Euphorbiaceae、Brassicaceae等具有高度保守的bHLH结构域(图1A)。在十字花科中,一个基因复制事件导致了HEC3和IND(Yan et al. 2020)。在bHLH结构域,HEC3和IND之间有8个不同的保守氨基酸(图1A中编号为1 ~ 8)。在CsIVP bHLH结构域内,6个保守氨基酸(1,2,5,6,7,8)与HEC3相同,1个(4)与IND相同,1个(3)与HEC3和IND不同(图1A)。此外,与所有家族相比,CsIVP bHLH结构域中有一个(9)氨基酸具有唯一性(图1A)。为了研究CsIVP在拟南芥中的表达情况,构建了pCsIVP-GUS-表达的拟南芥细胞系。β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)活性集中在根、茎和叶的维管组织中(图1B-I)。

 

  图1 CsIVP同源物蛋白分析及β-葡萄糖苷酶(GUS)检测结果。(A) 30个物种IVP同源物的蛋白质序列比对。序列上的红线表示保守的bHLH域。紫色代表豆科基因,粉色代表蔷薇科基因,红色代表葫芦科基因,黄色代表杨柳科基因,深粉色代表大戟科基因,蓝色代表十字花科基因。红色数字1到9代表变异氨基酸。CsIVP启动子驱动拟南芥(B-I) GUS基因的表达。

 

  本研究表明,CsIVP-RNAi诱导黄瓜植株叶片和维管的变化可以增强植株对缺氮和高温胁迫的抗性,如图2。CsIVP基因敲低后,矮化植株的维管组织增大,叶片向下卷曲(图2A-E)。CsIVP-RNAi植株成熟叶片的角质层较野生型叶片明显增厚(图2F-I)。转录组数据的功能分类富集分析显示,在CsIVP-RNAi植物叶脉中上调的基因中,与温度和强光响应、细胞水分稳态、韧皮部运输和营养水平响应调控相关的基因显著富集(图2J, K;图S1A-D),表明CsIVP可能促进非生物应激反应。CsIVP可能通过与参与非生物胁迫调控通路的特定基因相互作用来调控非生物胁迫的反应。

 

  图2 WT和CsIVP-RNAi转基因植株的表型和转录组分析 (A-D) CsIVP-RNAi系R5、R3和R2的矮化形态。(E) qRT-PCR验证CsIVP- rnai系中CsIVP表达降低。(F-I)利用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)对WT和CsIVP-RNAi植株的叶表皮细胞进行成像。(J-K)与WT相比,CsIVP-RNAi转基因植株中上调和下调基因的基因分类富集。比例尺代表(A-D)中2 cm, (F, H)中20μm, (G, I)中5μm。(E)中的误差条代表三个生物重复的标准偏差。

 

  评估了CsIVP如何影响营养转运。野生型和转基因株系均受氮(N)限制。值得注意的是,转基因植株比野生型幼苗更能抵抗氮的限制,这可以从转基因植株比野生型幼苗更少的褪色绿叶中看出(图3A)。N限制4 d后,WT植株的3个老真叶呈浅绿色,叶绿素含量较低,为典型的早期N缺乏症状,而CsIVP-RNAi植株只有第三个真叶呈现这一症状,叶绿素含量较高(图3A、B)。在N限制条件下,CsIVP-RNAi植株的幼叶和根系干重均低于WT植株,而老叶干重则高于WT植株(图3D)。在本研究中,WT幼苗对N限制很敏感,根系纵向生长异常,而CsIVP-RNAi植株对N缺乏的耐受性更强,与对照植株相比,根系长度仅表现出微小差异(图3C, E)。在全营养液中生长时,CsIVP-RNAi转基因植株的幼叶氮、磷、钾浓度高于野生型植株,而老叶氮、磷、钾浓度低于野生型植株(图3F-H)。在N限制条件下,CsIVP-RNAi植株的幼叶、老叶和根系的N浓度显著高于WT植株(图3F),说明转基因植株的转运或吸收能力更强。在低氮胁迫下,CsIVP负向调控高硝酸盐亲和转运蛋白(NRT2.1、NRT2.5)和再分配转运蛋白(NRT1.7、NRT1.9、NRT1.12),如图4。

 

  图3 CsIVP-RNAi植物对氮缺乏的响应及相关生理测量。(A-C)充足氮(CK)和缺氮条件下CsIVP-RNAi植株的表型特征。(D)对照和缺氮条件下,WT和CsIVP-RNAi转基因植株(R5)的幼叶、老叶和根的干重。(E)对照和缺氮条件下WT和CsIVP-RNAi转基因植株(R5)的根长。(F)对照和缺氮条件下,野生型(WT)和CsIVP-RNAi转基因植株(R5)幼叶、老叶和根的氮浓度。(G-H)营养充足的WT和CsIVP-RNAi (R5)植株的幼叶、老叶和根中磷和钾的浓度。比例尺代表2cm in (A-C)。(D-H)中的误差条表示三个生物重复的标准差。双星号表示差异显著,P < 0.01 (Student’s t检验)。

 

  为研究CsIVP-RNAi转基因植株的耐热性,将WT和R5转基因植株置于高温条件下。在将植物暴露在高温下一天后,WT植株的叶片表现出典型的热敏症状,即叶片向下卷曲,边缘呈棕色,而直线R5植株的叶片保持正常,呈绿色(图5A)。WT植株的死亡率和叶热损伤水平高于R5植株(图5I, J)。WT的热损伤指数为0.5,而转基因植株的热损伤指数仅为0.34(图S4A)。通过测定叶片叶绿素荧光和光合系统参数,探讨高温胁迫下叶片的光合系统。WT植株PSII光化学的最大量子效率(Fv/Fm)和相对电子转移速率(ETR)均比R5植株降低(图5B, D),表明CsIVP-RNAi转基因植株在高温胁迫下表现出增强的光系统活性。CsIVP-RNAi植株在高温条件下具有较高的成活率和较低的热损伤水平。高温胁迫2天后,R5植株的耐热表型得到确认(图5E-H)。WT植株的叶片全部枯萎,光合能力显著下降,而R5植株只有底部的老叶枯萎(图5E-H)。如预期的那样,WT植株的Fv/Fm、非光化学猝灭(NPQ)和ETR比R5植株下降(图5F-H)。此外,其他三个光合系统参数[即光化学猝灭(qP)、光系统II的量子产量(Φ PS II)、非光化学猝灭(qN)]与R5植株光合能力的提高相一致。WT植株高温暴露后的死亡率达到12%,而R5株系未发现植株死亡(图5I)。这些结果表明,CsIVP在高温反应中起着抑制因子的作用。

 

  图4对照和缺氮条件下WT和R5植株中硝酸盐转运体的表达量(A-C)硝酸盐转运蛋白基因在对照和缺氮条件下WT和R5植株的幼叶(A)、老叶(B)和根(C)中的表达。采用定量逆转录(qRT)-PCR数据进行聚类分析。数据为三次生物复制的平均值。

 

  图5 CsIVP-RNAi植物对高温的响应及相关生理测量。(A-D)高温胁迫1 D后WT和CsIVP-RNAi植株的表型特征(A)和Fv/Fm (B)、NPQ (C)和ETR (D)测量。(E-H)高温胁迫2 d后WT和CsIVP-RNAi植株的表型特征(E)和Fv/Fm (F)、NPQ (G)和ETR (H)的测定。Fv/Fm,PS II光化学的最大量子产额(也称原始光化学最大产额);NPQ non-photochemical淬火;ETR,相对电子转移速率。(I) WT和R5植株在高温条件下暴露1、2天后的死亡率。(J) WT和R5植株在高温条件下暴露1和2 d后的叶片热损伤水平。(K) CsIVP转基因植株与野生型植株高温响应相关基因的聚类分析。光合表型参数利用PlantExplorer系统测量。

 

  一些关键的高温调节因子,包括Hsfs、Hsps、DREB2C、MBF1b和WRKY33在CsIVP-RNAi植物中有显著表达。CsIVP作为一个阻遏因子,通过与CsDREB2C的物理交互作用,介导了对高温的响应(图6)。CsIVP在高温胁迫下对CsDREB2C信号通路起负向作用的假设工作模型(图7)。

 

  图6通过酵母双杂交(yeast two hybrid,YTH)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)检测CsIVP与CsDREB2C的相互作用。(A) Y2H揭示了CsIVP和CsDREB2C之间的物理相互作用。pGADT7-RecT和pGBDT7-53作为阳性对照;pGADT7-RecT和pGBDT7-Lam作为阴性对照。(B)采用BiFC法检测了CsIVP和CsDREB2C在烟叶中的物理相互作用。以CsGI-YFPC 和CsSPL-YFPN作为阳性对照。

 

  图7 CsIVP在耐高温下的假定工作模型。(A) CsIVP可能作为热诱导DREB2C信号通路的抑制因子,通过与CsDREB2C物理交互作用降低了黄瓜植株的高温抗性。(B) CsIVP抑制引起的DREB2C信号通路未被阻断增强了CsIVP-RNAi黄瓜植株的耐高温性。

 

  综上所述,CsIVP整合了植物发育、营养运输和高温抗性的先天编程,为选育营养高效和耐热的作物提供了一个潜在的有价值的目标。

 

  来源:Shuangshuang Yan, Bingwei Yu, Fangyan Ming, Yonggui Liang, Yanting Zhong, Zhongyi Wang, Xiaolan Zhang, Xuexian Li, Zhengkun Qiu, Bihao Cao, CsIVP Modulates Low Nitrogen and High-Temperature Resistance in Cucumber, Plant and Cell Physiology, 2022;, pcac020, https://doi.org/10.1093/pcp/pcac020

 

  编辑:王春颖

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